NHS-LC生物素是一種長(zhǎng)鏈、NHS酯活化的生物素化試劑，用于標(biāo)記伯胺（例如蛋白賴氨酸），其膜通透性使其可用于一般細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記。磺基NHS-LC生物素是水溶性的、不可切割的，可以對(duì)溶液中的抗體、蛋白質(zhì)和任何其他含伯胺的大分子進(jìn)行簡(jiǎn)單有效的生物素化試劑，細(xì)胞表面蛋白的特異性標(biāo)記是這些獨(dú)特的水溶性和膜不可滲透試劑的另一個(gè)常見應(yīng)用。

Katsumi團(tuán)隊(duì)2001年發(fā)表《一種利用內(nèi)皮生物素化和抗生物素蛋白-生物素系統(tǒng)的新型血管內(nèi)給藥方法》，此項(xiàng)研究中開發(fā)了一種新型血管內(nèi)給藥系統(tǒng)，將從導(dǎo)管注射的藥物固定到靶組織的血管系統(tǒng)中，活內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞蛋白第一時(shí)間順利獲得生物素化試劑直接生物素化，然后順利獲得親和藥物或使用親和素作為接頭的生物素化藥物結(jié)合。

在最初的實(shí)驗(yàn)中，在體外研究了培養(yǎng)的牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞（BAECs）的生物素化，方法是將生物素化試劑（NHS-LC生物素或磺基-NHS-LC生物素）應(yīng)用于洗滌過的完整BAEC單層上，并表明與細(xì)胞結(jié)合的生物素量取決于所應(yīng)用的生物素試劑的濃度。將細(xì)胞裂解物中生物素的濃度除以裂解物中的蛋白質(zhì)濃度（ng生物素/μg蛋白質(zhì)），以使其值標(biāo)準(zhǔn)化，以應(yīng)對(duì)實(shí)驗(yàn)過程中可能的細(xì)胞損失。圖1顯示了生物素化試劑的劑量與細(xì)胞裂解物中校正的生物素濃度之間的關(guān)系。細(xì)胞裂解物中生物素的濃度隨著生物素化試劑劑量的增加而增加。當(dāng)在相同濃度下比較NHS-LC-生物素和磺基NHS-LC生物素時(shí)，NHS-LC生物素的生物素化的細(xì)胞蛋白略多。例如，由1.8mM NHS-LC生物素和磺基NHS-LC生物素制備的細(xì)胞裂解物的生物素濃度分別為0.390和0.304ng每1g蛋白質(zhì)。

在生物素化后，細(xì)胞結(jié)合的生物素隨著時(shí)間的推移而減少，當(dāng)熒光素標(biāo)記的親和素（FITC-avidin）應(yīng)用于生物素化的BAEC單層時(shí)，F(xiàn)ITC-親和素很容易與細(xì)胞結(jié)合。LDH釋放測(cè)定顯示磺基NHS-LC生物素對(duì)BAEC只有輕微的細(xì)胞毒性，集落形成測(cè)定顯示試劑只有輕微的不良反應(yīng)。對(duì)正常家兔的腎動(dòng)脈進(jìn)行了體內(nèi)研究，順利獲得導(dǎo)管將NHS-LC生物素溶液注射到一個(gè)腎臟，以生物素化其血管系統(tǒng)，并將載體注射到另一個(gè)腎臟作為對(duì)照，然后用鹽水灌注。最后，將FITC-avidin溶液注射到兩個(gè)腎臟，然后在拔出導(dǎo)管后與血液再次融合。在組織學(xué)切片中，生物素化腎臟中超過85%的腎小球被熒光素染色，而對(duì)照組中沒有腎小球被染色。在相同手術(shù)后2天采集的腎臟中，大多數(shù)腎小球仍然染色明亮。圖2顯示，在生物素化后，EC中的生物素濃度隨著時(shí)間的推移而降低。當(dāng)使用磺基NHS-LC生物素時(shí)，生物素化蛋白的濃度隨著時(shí)間的推移迅速下降，24小時(shí)后只剩下少量。另一方面，當(dāng)使用NHS-LC-生物素時(shí)時(shí)，在24小時(shí)內(nèi)檢測(cè)到大量的生物素分子（60%），在48小時(shí)時(shí)仍能檢測(cè)到約40%。根據(jù)數(shù)據(jù)計(jì)算出的生物素半衰期分別為38.0小時(shí)（NHS-LC生物素）和10.8小時(shí)（磺基-NHS LC-生物素）。

在用0.18-18mM的磺基NHS-LC生物素和暴露于溶劑中進(jìn)行對(duì)照，生物素化24小時(shí)后順利獲得相差顯微鏡檢查了所有的BAEC，所有組的細(xì)胞均為陰性，未顯示任何形態(tài)異常。另一方面，如圖3所示，與低劑量（0、0.18和1.8mM）的生物素化相比，暴露于18mM生物素化試劑的組顯示LDH水平略有增加（克魯斯卡爾-沃利斯檢驗(yàn)，p＜0.02）。

為了研究生物素化抑制劑是否會(huì)改變細(xì)胞活性，使用集落形成測(cè)定法檢測(cè)了它們對(duì)細(xì)胞增殖的影響。如圖4所示，BAEC集落的數(shù)量隨著試劑濃度的增加而減少。菌落形成的抑制在1.8-5.4mM時(shí)是明顯的（克魯斯卡爾-沃利斯檢驗(yàn)檢驗(yàn)，p<0.01）。

在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，還研究了抗生物素化藥物是否可以固定在有活力的生物素化EC上。結(jié)果如圖5所示，細(xì)胞裂解物中FITC抗生物素的濃度隨著FITC抗病毒素初始劑量的增加而增加。當(dāng)使用NHS-LC生物素時(shí)，F(xiàn)ITC-avidin的初始劑量與其在細(xì)胞裂解物中的濃度之間的相關(guān)系數(shù)為0.987（p=0.012），而當(dāng)使用磺基NHS-LC-生物素時(shí)為0.977（p=0.026）。

在最終的實(shí)驗(yàn)中，生物素化的腎臟注射抗生物素溶液，然后注射熒光素-生物素溶液。對(duì)照腎臟先前沒有生物素化，但接受了與上述相同的抗生物素和熒光素生物素注射，超過80%的腎小球在生物素化的腎臟中染色，但在對(duì)照組中沒有染色。這表明生物素化藥物可以順利獲得抗生物素錨定在生物素化血管系統(tǒng)上，而不會(huì)被血液沖走。生物素化腎臟的功能未發(fā)現(xiàn)明顯的不良反應(yīng)，這種給藥系統(tǒng)適用于治療某些血管病理狀況，如惡性腫瘤中的微血管增殖，以及在某些靶器官中陸續(xù)在給藥。

在這項(xiàng)研究中，研究了活內(nèi)皮細(xì)胞的生物素化，以開發(fā)一種將治療藥物遞送到靶區(qū)并將藥物錨定到該區(qū)域的血管內(nèi)皮細(xì)胞的方法。這項(xiàng)研究的兩個(gè)關(guān)鍵要素是導(dǎo)管插入術(shù)在藥物遞送中的應(yīng)用和NHS酯的生物素衍生物在生物素化中的使用。介入放射學(xué)的最新進(jìn)展使得使用血管導(dǎo)管插入術(shù)到達(dá)身體的許多地方成為可能，使用導(dǎo)管插入術(shù)，我們將藥物輸送到作為模型器官的兔腎臟中的血管內(nèi)皮細(xì)胞。一些研究人員之前已經(jīng)報(bào)道了動(dòng)物組織細(xì)胞的生物素化，如紅細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，使用生物素NHS酯衍生物用于各種目的。NHS酯與蛋白質(zhì)具有高度反應(yīng)性，與NHS酯的化合物可以順利獲得細(xì)胞蛋白質(zhì)固定在活細(xì)胞上。Fuente等人報(bào)道了使用分離的肺對(duì)肺內(nèi)皮進(jìn)行生物素化，然后順利獲得血管內(nèi)注射給予生物素化試劑。Katsumi團(tuán)隊(duì)的研究首次將血管內(nèi)皮細(xì)胞的生物素化用于治療目的。